Kloning Pada Tumbuhan

a.      Pengertian Kloning Tumbuhan

Nama lain dari kloning pada tumbuhan adalah kultur jaringan, yaitu suatu teknik untuk mengisolasi sel, protoplasma, jaringan, dan organ dan menumbuhkan bagian tersebut pada nutrisi yang mengandung zat pengatur tumbuh tanaman pada kondisi aseptik, sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman sempurna kembali.

Secara singkat kloning pada sel tumbuhan (baik dari akar, batang, dan daun) bisa dilakukan dengan cara memotong organ tumbuhan yang diinginkan. Lalu kita mencari eksplan, mengambil selnya dan memindahkan ke media berisi nutrisi agar cepat tumbuh. Eksplan ini akan menggumpal menjadi gumpalan yang bernama kalus. Kalus adalah cikal bakal akar, batang, dan daun. Kalus kemudian ditanam di media tanah dan akan menjadi sebuah tanaman baru.

b.      Sejarah Kloning Tumbuhan

Sejarah perkembangan teknik kultur jaringan dimulai pada tahun 1838 ketika Schwann dan Schleiden mengemukakan teori totipotensi yang menyatakan bahwa sel-sel bersifat otonom, dan pada prinsipnya mampu beregenerasi menjadi tanaman lengkap. Teori yang dikemukakan ini merupakan dasar dari spekulasi Haberlandt pada awal abad ke-20 yang menyatakan bahwa jaringan tanaman dapat diisolasi dan dikultur dan berkembang menjadi tanaman normal dengan melakukan manipulasi terhadap kondisi lingkungan dan nutrisinya. Walaupun usaha Haberlandt menerapakan teknik kultur jaringan tanaman pada tahun 1902 mengalami kegagalan, namun antara tahun 1907-1909 Harrison, Burrows, dan Carrel berhasil mengkulturkan jaringan hewan dan manusia secara in vitro.

 Keberhasilan aplikasi teknik kultur jaringan sebagai sarana perbanyakan tanaman secara vegetatif pertama kali dilaporkan oleh White pada tahun 1934, yakni melalui kultur akar tomat. Selanjutnya pada tahun 1939, Gautheret, Nobecourt, dan white berhasil menumbuhkan kalus tembakau dan wortel secara in vitro. Setelah Perang Dunia II, perkembangan teknik kultur jaringan sangat cepat, dan menghasilkan berbagai penelitian yang memiliki arti penting bagi dunia pertanian, kehutanan, dan hortikultura yang telah dipublikasikan.

Pada awalnya, perkembangan teknik kultur jaringan tanaman berada di belakang teknik kultur jaringan manusia. Hal itu disebabkan lambatnya penemuan hormon tanaman (zat pengatur tumbuh). Ditemukakannya auksin IAA pada tahun 1934 oleh Kögl dan Haagen-Smith telah membuka peluang yang besar bagi kemajuan kultur jaringan tanaman. Kemajuan ini semakain pesat setelah ditemukannya kinetin (suatu sitokinin) pada tahun 1955 oleh Miller dan koleganya. Pada tahun1957, Skoog dan Miller mempublikasikan suatu tulisan ”kunci” yang menyatakan bahwa interaksi kuantitatif antara auksin dan sitokinin berpengaruh menentukan tipe pertumbuhan dan peristiwa morfogenetik di dalam tanaman. Penelitian kedua ilmuwan tersebut pada tanaman tembakau mengungkapkan bahwa rasio yang tinggi antara auksin terhadap sitokinin akan menginduksi morfogenesis akar, sedangkan rasio yang rendah akan menginduksi morfogenesis pucuk. Namun pola yang demikian ternyata tidak berlaku secara universal untuk semua spesis tanaman.

Ditemukannya prosedur perbanyakan secara in vitro pada tanaman anggrek Cymbidium 1960 oleh Morel, serta diformulasikannya komposisi medium dengan konsentrasi garam mineral yang tinggi oleh Murashige dan Skoog pada tahun 1962, semakin merangsang perkembangan aplikasi teknik kultur jaringan pada berbagai spesies tanaman. Perkembangan yang pesat pertama kali dimulai di Perancis dan Amerika, kemudian teknik inipun di kembangkan di banyak negara, termasuk Indonesia, dengan prioritas aplikasi pada sejumlah tanaman yang memiliki arti penting bagi masing-masing negara.

Meningkatnya penelitian kultur jaringan dalam dua dekade terakhir telah memberi sumbangan yang sangat besar bagi ahli pertanian, pemuliaan tanaman, botani, biologi molekuler, biokimia penyakit tanaman, dan sebagainya. Karena kultur jaringan telah mencapai konsekuensi praktis yang demikian jauh di bidang pertanian, pemuliaan tanaman dan sebagainya maka dapat dipastikan junlah penelitian dan aplikasi teknik ini akan terus meningkat pada masa-masa mendatang. Pierik (1997) mengemukakan sejumlah peristiwa penting dalam sejarah perkembangan kultur jaringan hingga dekade 1980 an sebagai berikut:

·         1892 Ditemukan fenomena sintesis senyawa-senyawa pembentuk organ yang didistribusikan secara polar di dalam tanaman.

·         1902        Usaha perrtama aplikasi kultur jaringan tanaman.

·         1904    Usaha pertama aplikasi kuktur embrio sejumlah tanaman Cruciferae

·         1909   Fusi protoplas tanaman, namun produk yang dihasilkan mengalami kegagalan untuk hidup.

·         1922    Perkecambahan in vitro biji anggrek secara asimbiosis.

·         1922    Kultur in vitro ujung akar

·         1925    Aplikasi kultur embrio pada tanaman Linum hasil silang antar spesies

·         1929    Kultur embrio Linum untuk menghindari inkompatibilitas persilangan

·         1934    Kultur in vitro jaringan kambium dari sejumlah tanaman pohon dan perdu mengalami kegagalan karena tidak adanya ketrelibatan auksin

·         1934    Keberhasilan kultur akar tanaman tomat.

·         1936    Kultur embrio sejumlah tanaman Gymnospermae

·         1939    Keberhasilan menumbuhkan kultur kalus secara kontinu

·   1940    Kultur in vitro jaringan kambium dari tanaman Ulmus untuk mempelajari pembantukan tunas adventif

·    1941    Air kelapa (Yang mengandung faktor pembelahan sel) untuk pertama kalinya digunakan pada kultur embrio tanaman Datura

·         1941    Kultur in vitro jaringan tumor crown-gall

·   1944    Untuk pertama kalinya kultur in vitro tembakau digunakan pada penelitian pembantukan tunas adventif

·         1945    Budi daya potongan tunas tanaman Asparagus secara in vitro

·         1946    Untuk pertama kalinya diperoleh tanaman Lupinus dan Tropaelum dari kultur pucuk

·         1948    Pembentukan akar dan tunas adventif tanaman tembakau ditentukan oleh rasio auksin : adenin

·         1950    Regenerasi organ tanaman dari jaringan kalus Sequoia sempervirens.

·         1952    Aplikasi sambung mikro (micrografiting) untuk pertama kalinya

·         1953    Produksi kalus haploid tanaman Ginkgo biloba dari kultur serbuk sari

·         1954    Pengkajian terhadap perubahan-perubahan kariologi dan sifat-sifat kromosom pada kultur endosperm tanaman jagung

·         1955    Penemuan kinetin, yaitu suatu hormon perangsang pembelahan sel.

·         1956    Realisasi pertumbuhan kultur di dalam sistem multiliter untuk menghasilkan metabolit sekunder.

·         1957    Ditemukannya pengaturan pembentukan organ (akar dan pucuk) dengan mengubah rasio antara auksin dan sitokinin

·         1958    Regenerasi embrio somatik secara in vitro dari jaringan nuselus tanaman Citrus ovules

·         1958    Regenerasi proembrio dari massa kalus dan suspensi sel tanaman wortel

·         1959    Publikasi buku pegangan mengenai kultur jaringan tanaman untuk pertama kali

·         1960    Keberhasilan pembuahan in vitro pada Papaver rhoeas untuk pertama kalinya

·       1960    Degradasi dinding sel secara enzimatik untuk memperoleh protoplas dalam jumlah besar.

·         1960    Perbanyakan vegetatif tanaman anggrek melalui kultur meristem

·         1960    Filtrasi suspensi sel dan isolasi sel tunggal

·         1962    Pengembangan medium dasar Murashige dan Skoog (MS)

·         1964    Produksi tanaman Datura haploid dari kultur serbuk sari untuk pertama kalinya

·         1964    Regenerasi tunas dan akar pada jaringan kalus tanaman Populus tremuloides

·         1965    Induksi pembungaan secara in vitro pada tanaman tembakau

·         1965    Diferensiasi tanaman tembakau dari isolasi sel tunggal pada kultur mikro

·         1967    Induksi pembentukan bunga pada Lunaria annua dengan vernalisasi secara in vitro

·       1967    Produksi tanaman haploid dari kuktur serbuk sari tanaman tembakau (Nicotiana tabacum).

·         1969    Analisis kariologi tanaman yang diregenerasikan dari kultur kalus tembakau.

·     1969    Keberhasilan isolasi protoplas dari kultur suspensi Haplopappus gracilis untuk pertama kalinya

·         1970    Seleksi mutan biokimia secara in vitro

·         1970    Pemanfaatan kultur embrio untuk menghasilkan barley monoploid

·         1970    Keberhasilan peleburan protoplas untuk pertama kalinya

·         1971    Keberhasilan regenerasi tanaman dari kultur protoplas untuk pertama kalinya.

·         1972    Hibridisasi antarspesies melalui peleburan protoplas pada dua spesies Nicotiana

·         1973    Sitokinin diketahui mampu memecahkan dormansi pada eksplan jaringan kapitulum tanaman Gerbera

·         1974    Induksi percabangan aksilar oleh sitokinin pada eksplan tunas tanaman Gerbera.

·         1974    Regenerasi Petunia hybrida haploid dari kultur protoplas.

·         1974    Diketahui bahwa peleburan protoplas haploid dapat dilakukan sehingga mendukung hibridisasi

·         1974    Biotransformasi pada kultur jaringan tanaman

·         1974    Penemuan Ti-plasmid pada Agrobacterium sebagai senyawa penginduksi pembentukan tumor

·         1975    Seleksi positif terhadap kultur kalus tanaman jagung yang resisten terhadap Helminthosporium maydis.

·         1976    Inisiasi pucuk dari eksplan tunas tanaman anyelir yang berasal dari penyimpanan pada suhu rendah (kreopreservasi).

·         1976    Hibridisasi antarspesies melalui peleburan protoplas pada tanaman Petunia hybrida dan P. Parodii.

·         1976    Sintesis dan perombakan oktopin dan nopalin diketahui dikontrol secara genetis oleh Ti-plasmid Agrobacterium tumefaciens.

·         1977    Keberhasilan integrasi DNA Ti-plasmid dari Agrobacterium tumefaciens  pada tanaman

·         1978    Hibridisasi somatik tomat dan kentang

·         1979    Pengembangan prosedur co-cultivation untuk teransformasi protoplas tanaman dengan Agrobacterium

·         1980    Pemanfaatan sel untuk biotransformasi digitoksin menjadidigoksin

·         1981    Pengenalan istilah variasi somaklon atau keragaman somaklon

·         1981    Isolasi auksotrop melalui skrining berskala besar terhadap koloni sel yang diperoleh dari protoplas haploid tanaman Nicotiana plumbaginifolia dengan perlakuan mutagen.

·         1982    Protoplas dapat bergabung dengan DNA telanjang sehingga memungkinkan untuk dilakukannya transformasi dengan isolasi DNA.

·         1983    Hibidisasi sitoplasma antargenus pada tanaman bit dan Brassica napus

·         1984    Transformasi sel tanaman dengan DNA plasmid

·         1985    Infeksi dan transformasi potongan daun dengan Agrobacterium tumefaciens dan regenerasi tanaman yang mengalami transformasi

            Sejak tahun 1980-an sampai sekarang, teknik kultur jaringan tanaman sudah berkembang sangat pesat di seluruh penjuru dunia sehingga sulit untuk dipantau. Terlebih lagi, banyak terobosan yang memiliki nilai komersial tinggi yang diciptakan oleh institusi-institusi riset pada berbagai perusahaan besar yang tidak dipublikasikan. Pemanfaatan yang nyata dari teknik tersebut, disamping untuk perbanyakan tanaman, juga di bidang rekayasa genetika (genetic engineering) untuk perbaikan mutu genetika tanaman pertanian. Sudah banyak varietas, bahkan spesies baru yang diciptakan melalui teknik fusi protoplas. Demikian pula dengan aplikasi teknik tersebut pada eliminasi penyakit, terutama penyakit virus dan produksi metabolit sekunder dengan bantuan Agrobacterium sudah menjadi teknik yang rutin dilakukan oleh para pakar di berbagai penjuru dunia, termasuk Indonesia. Hanya saja aplikasi teknik kultur jaringan untuk pelestarian plasma nutfah tampaknya masih harus menempuh perjalanan panjang untuk sampai pada sasaran yang diharapkan.

c.       Proses Kloning Tumbuhan

Tahapan yang dilakukan dalam perbanyakan tanaman dengan teknik kultur jaringan adalah :

 

1.      Pembuatan media

Tanaman tersebut harus jelas jenis, spesies, dan varietasnya serta harus sehat dan bebas dari hama dan penyakit. Tanaman indukan sumber eksplan tersebut harus dikondisikan dan dipersiapkan secara khusus di rumah kaca atau greenhouse agar eksplan yang akan dikulturkan sehat dan dapat tumbuh baik serta bebas dari sumber kontaminan pada waktu dikulturkan secara in-vitro.

Teknik kuljar secara in vitro, beberapa syarat sesuai dengan prinsip dasar kuljar yang harus diketahui antara lain :

·         Memilih eksplan yang baik

·         Untuk mendapatkan eksplan yang baik dan mudah tumbuh, dipilih bagian organ yang masih bersifat meristematik

·         Penggunaan medium yang cocok. Media yang biasa digunakan untuk pembuatan kuljar murni adalah PDA.

·         Keadaan yang aseptik. Keadaan yang aseptik ini meliputi sterilisasi eksplan, media, alat-alat, ruang steril dan ruang kultur (entkas / tempat khusus untuk menanam eksplan ke dalam medium).

·         Pengaturan udara yang baik

2.      Inisiasi

Inisiasi adalah pengambilan eksplan dari bagian tanaman yang akan dikulturkan. Bagian tanaman yang sering digunakan untuk kegiatan kultur jaringan adalah tunas.

3.      Sterilisasi

Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril.  Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan. Teknisi yang melakukan kultur jaringan juga harus steril.

4.      Multiplikasi

Multiplikasi adalah kegiatan memperbanyak calon tanaman dengan menanam eksplan pada media. Kegiatan ini dilakukan di laminar flow untuk menghindari adanya kontaminasi yang menyebabkan gagalnya pertumbuhan eksplan. Tabung reaksi yang telah ditanami eksplan diletakkan pada rak-rak dan ditempatkan di tempat yang steril dengan suhu kamar.

5.      Pengakaran

Pengakaran adalah fase dimana eksplan akan menunjukkan adanya pertumbuhan akar yang menandai bahwa proses kultur jaringan yang dilakukan mulai berjalan dengan baik. Pengamatan dilakukan setiap hari untuk melihat pertumbuhan dan perkembangan akar serta untuk melihat adanya kontaminasi oleh bakteri ataupun jamur.

6.      Aklimatisasi

Aklimatisasi adalah kegiatan memindahkan eksplan keluar dari ruangan aseptic ke bedeng. Pemindahan dilakukan secara hati-hati dan bertahap, yaitu dengan memberikan sungkup

Share this post